Copyright © Перевод Елены Фёдоровой 

Genetic differentiation in pointing dog breeds inferred from microsatellites and mitochondrial DNA sequence. Parra D, Méndez S, Cañón J, Dunner S. Department of Animal Production, Veterinary Faculty, Universidad Complutense, 28040 Madrid, Spain.


Резюме

Среди последних генетических анализов пород собак не было исследований, посвященных происхождению легавых собак, не смотря на то, что охота была одной из самых первых причин одомашнивания собак. Данное генетическое исследование было посвящено выяснению родственности 5 самых популярных легавых пород (английский сеттер, пойнтер, бриттани, дратхаар и курцхаар) на основе анализа митохондриального ДНК (mtDNA), аутосомно-маркеров и гаплогрупп.

Мы выделили 236 аллелей в аутосомных микросателлитах, 4 гаплогруппы гаплотипов и 18 митохондриальных гаплотипов. Средние показатели F(ST) были 11.2, 14.4 и 13,1 – соответственно - для аутосомов, маркеров микросателлитов гаплогруппы и mtDNA, что отражает относительно высокие генетические различия в происхождении этих пород.

Большие генетические различия, выявленные у данных легавых пород (61,7-68,2), указывают на то, что они происходят от разных предков. Однако эти предки происходят от единого прапредка.

Как показал анализ аутосомно-маркеров английский сеттер происходит от староиспанского пойнтера, поскольку он единственный входит в независимый кластер и, возможно, он делит общее материнское происхождение с пойнтером и курцхааром, либо имеет общее материнское происхождение с одной из британских пород или староиспанского пойнтера, который был ввезен на Британские острова примерно в 14-16 веках.

Анализ mtDNA потвердил происхождение бриттани, о чем имеются также и документальные свидетельства, что он происходит от скрещивания дратхаара и курцхара с другими породами. Наш генетический анализ в этом случае согласуется с историческими документами.

Введение

Домашние собаки - Canis familiaris L. - являются примером крайней фенотипической изменчивости. Это проявляется в разных признаках, варьирующихся от окраса шерсти до сложных заболеваний. Кроме того, собаки имеют различную морфологию (Parker & Ostrander 2005) и типы поведения (Sundqvist et al., 2006). Эти признаки характеризуют породы и являются причиной и следствием одомашнивания собак (Olsen 1985; Clutton-Brock 1987).

Несмотря на крайнее разнообразие в фенотипе, собаки не слишком сильно отличаются от своих диких предков - серых волков (Canis lupus) (Wayne & Ostrander 1999). Генетическая структура домашних собака была изучена с помощью митохондриальной ДНК (mtDNA) (Tsuda et al. 1997; Vila` et al. 1997; 1999) или маркеров микросателлитов (Koskinen & Bredbacka 2000; Irion et al. 2003; Parker et al. 2004). Изменения, обнаруженные в mtDNA, указывают, что все собаки происходят из общего генофонда. Parker et al. (2004) исследовал взаимосвязь 414 собак, представляющих 85 пород, используя Байесовскую базовую модель алгоритма кластеризации (Pritchard et al. 2000) для идентификации генетически различных подгрупп субпопуляций на основе микросателлитных маркеров аллельных частот. Этот алгоритм распределяет породы собак в раздельные уникальные кластеры.

Однако, в эти исследования не были включены охотничьи птичьи породы, хотя охота является одной из первых причин интереса человека к одомашниванию собак, в результате которого некоторые породы были искуственно выведены 4000 лет назад (Clutton-Brock 1987) на Ближнем Востоке и в Северной Африке.

Предки современных охотничьих птичьих пород были собаками, которые останавливались перед дичью. В XVII веке, когда охотники начали использовать огнестрельное оружие, собаки должны были искать и останавливаться перед дичью, чтобы не попасть под выстрел охотника, поэтому резко возрос интерес к легавым породам. Международная кинологическая федерация (http://www.fci.be) включила легавые породы в VII породную группу, в которую вошло 38 пород из 12 стран, происхолящих от одного признанного предка – староиспанского пойнтера - породы, которая практически исчезла (Arkwright 1902). Этот общий предок вероятно был выведен примерно в 100–250 гг. до н.э. и имел два типа: короткошерстный (который был распространен на всей территории Пиренейского полуострова) и длинношерстный (который был распространен в северной части Пиренейского полуострова, возможно по обе стороны от Пиренеев).

Учитывая историческое значение охотничьих собак, мы исследовали происхождение охотничьих птичьих пород на основе молекулярных данных, связанных с гендерным наследованием в породах и их генетическими особенностями. В этом исследовании рассматриваются генетических связи 5 самых популярных современных охотничьих птичьих пород на основе трех типов молекулярных маркеров.

Материалы и методы

Материал для исследований

В исследовании были использованы 173 собаки из Испании, представляющие 5 основных легавых пород: курцхаар (GSP; n = 31), дратхаар (DD; n = 10), бриттани (EB; n = 16), пойнтер (EP; n = 50) и английский сеттер (ES; n = 66). Для анализа были взяты пробы крови у собак, участвовавших в полевых испытаниях, организованных Испанской охотничьей федерацией.

Микросателлиты

21 аутосомный микросателлит и 4 микросателлита Y хромосомы были выбраны на основе их прогнозируемой генетической изменчивости (см. таблицу S1). Микросателлиты Y хромосомы (MS34A, MS34B, MS41A и MS41B) были проанализированы с использованием только двух пар праймеров, MS34 и MS41 (Olivier et al. 1999), поскольку каждый фрагмент содержит два разных микросателлита локуса (Sundqvist et al. 2001). Микросателлиты Y хромосомы были определены у 90 кобелей (GSP = 10, DD = 4, EB = 7, EP = 27 и ES = 42).

Митохондриальные ДНК

Два фрагмента собачьей митохондриальной последовательности D-петли (U96639; Kim et al. 1998) были расширены с помощью следующих праймеров: 458-bp фрагмент, охватывающий нуклеотиды 15402–15860 (праймеры MITFOR: 5¢-GCTCTTGCTCCACCATCAGC-3¢ и MITREV: 5¢-ATCGAGATGTCCCATTTGCG-3¢) и 379-bp фрагмент, охватывающий нуклеотиды 15745–16124 (праймеры L16452: 5¢- GGGCCCATACTAACGTGGGG-3¢ и H222: 5¢-AACTATATGTCCTGAAACC-3¢; Vila` et al. 1997). Были проанализированы последовательности в митохондриальных ДНК у 52 кобелей и сук (ВСП = 10, DD = 10, EB = 10, EP = 10 и ES = 12). После амплификации и секвенирования с использованием стандартных методов последовательностей были определены области пересечения и была получена mtDNA последовательность _649 bp от позиции 15458–16105. Отдельные последовательности были увязаны с помощью программного обеспечения CLUSTALW 1,82 (Thompson et al., 1994). Эти последовательности были увязаны с другими шестью собачьими митохондриальными группами (Savolainen et al., 2002).

Анализ и обработка данных

Микроспутники полиморфизмов в локусе были проанализированы на предмет выявления количества аллелей. Эффективное количество аллелей (Kimura & Crow 1964), обозначенное как (Ho), и ожидаемое, обозначенное, как (He) было гетерозиготном. Был использован классический метод Wright-индексов (FIT, FIS и FST) (Wright 1965; Weir & Cockerham 1984). Полученные данные были обработаны с помощью программы GENETIX 4.03 (Belkhir et al., 2001). После этого данные (i) были протестированы по методу Hardy–Weinberg equilibrium (HWE), который разработан Guo & Thompson’s (1992), а также с помощью марковской цепи и метода Монте-Карло были объединены по признакам локус/популяция; (ii) был использован тест хи-квадрата для каждой пары локус/популяция методом Фишера, с помощью программы GENEPOP 3.33 (Raymond & Russe 1995). Гаплотипы были определены на основе аллелей по четырем гаплогруппам микроспутников; было рассчитано разнообразие по аллелям и гаплотипам. Кроме того, также была использована концепция молекулярной генеалогии (Caballero & Toro 2002) для определения генетического разнообразия в рамках пород.

Различные методы были использованы для анализа mtDNA. Была использована программа ARLEQUIN 2.00 (Schneider et al. 2000) для анализа нуклеотидов и разнообразия mtDNA; методика полиморфизма для анализа количества гаплотипов, эксклюзивных гаплотипов, количества сайтов, полиморфных различий нуклеотидов в каждом сайте, для определения разнообразия гаплотипов (генов) и нуклеотидов. Данные были проанализированы с использованием метода Fst-дистанций для индивидуумов, гаплотипов и пород. События вставки/удаления не были приняты во внимание. По стандарту погрешностей была оценена вероятность ошибок в 1000 итераций.

Генетические соотношения между породами были проанализированы с помощью трех методов.

Первый: парные Fst были использованы для определения генетических дистанций между породами, поскольку передача генов является основным фактором, способствующим генетическим дифференциациям между породами. До кластерного анализа, дистанции матриц были преобразованы по методу ультраметрических свойств (Weitzman 1992) в уникальные древа рендеринга независимо от применяемого алгоритма. Дендропрограммы, основанные на генетических дистанциях между породами, были получены с помощью процедуры UPGMA-кластеризации (Sneath & Sokal 1973) программы MEGA 2.0.

Второй: была использована программа STRUCTURE (Pritchard et al. 2000) для идентификации генетически различных субпопуляций с помощью моделей частот аллелей аутосомных микросателлитов. Этот метод оценивает долю индивидуального генома, полученного от каждого выявленного предка популяции, а также определяет общее количество предков у исследуемых собак. Был проведен анализ генетических кластеров на предмет наличия примесей моделей (Pritchard et al. 2000).

Третий: был использован анализ сети для визуализации пространственного распределения последовательностей в различиях между различными mtDNA гаплотипов. Этот метод на основе максимальной экономичности процедуры (Templeton et al. 1992), согласно одноименного алгоритма и анализа, проведенных с помощью программы TCS (Clement et al 2000) позволяет выявить возможную эволюцию пути (Bandelt et al., 1995).

Результаты

Генетическое разнообразие

Было идентифицировано у 21 аутосомного микросателлита 236 аллелей (137,2 на каждую породу) и 58 частных аллелей, что означает среднее значение - 6,5 аллелей в гене-маркере у каждой породы. Главные особенности и основные параметры этих разнообразных микросателлитов представлены в Таблице S1. Маркеры всех популяций показали очень большое количество аллелей в каждом маркере (значение = 11.2), т.е. - от 3 до 29, что контрастирует с низким показателем эффективного числа аллелей (ENA = 4.3). Существенных отклонений от HWE не было обнаружено за исключением маркера UCMCF96 у английских сеттеров. Аллели перечислены в таблице S2.

Как предполагалось, полиморфизмы у микросателлитов Y-хромосомы были меньше, чем у аутосомных маркеров. Никакого полиморфизма в маркерах Y-хромосомы не наблюдалось у немецких дратхааров. Только четыре Y-хромосомы гаплотипов или патрилинейности наблюдались у гаплотипов 1 и 2, которые наиболее часто встречались (Таблица S3) у всех собак.

Было выявлено 18 mtDNA в гаплотипах (в среднем по 4,7 на каждую породу). У 53% собак разных пород было выявлено 28% примесей посторонних гаплотипов, что указывает на высокое генетическое разнообразие, имеющееся внутри пород (таблица S4). Среднее значение для всех гаплотипов составило 1,45%. 8 гаплотипов принадлежат собакам групп A, B и C (Savolainen et al. 2002), остальные 10 гаплотипов имеются у всех пород, за исключением одной породы – немецкий курцхаар, у которой был выявлен новый гаплотип. Описание нового гаплотипа было направлено в GenBank (EF380216–EF380225).

Количество примесей иных пород было определено с помощью параметра Fis и результаты варьировались от 1,5% у немецких дратхааров до 4,4% у английских сеттеров (Таблица 1). Генеалогия каждой породы была рассчитана с учетом коэффициента инбридинга по методу родства Малекота. Распределение генетической изменчивости в пределах каждой породы (Gi) и генетического разнообразия, рассчитанное на основе различной молекулярной информации, показана в Таблице 1. Отрицательный показатель Fis у немецких дратхааров указывает на превышение показателя гетерозиготных генотипов над предполагаемым показателем HWE. У английских сеттеров был выявлен высокий показатель примесей пород и использования инбридинга. Следует отметить, что у 50% собак всех пород варьируется доля генетического разнообразия (Gi), что может быть результатом прилития кровей иных пород. Особенно очень высокое значение Gi отмечено у английского сеттера.

Среднее значение Fst составило: для аутосомно-микросателлитов 11.2; для микросателлитов Y-хромосом 14.4; mtDNA-информации 13.1, что отражает уровень дифференциации среди пород (Таблица 2). Высокая корреляция (r = 0,64) была отмечена между результатами, полученными для аутосомных локусов и локусов Y-хромосом, контрастируя с низкой корреляцией между результатами mtDNA и аутосомных маркеров (r = 0,22) и маркеров Y-хромосом (r = 0,14).

Генетические дистанции и кластеризация

Генетические дистанции среди пород, определенные по методу UPGMA-кластеризации FST дистанций матрицы аутосомно-микросателлитов, отражено в верхней части Графика 1. В нижней части этого Графика отражена филогения, основанная на информации, полученной по методу модели Байеса, что предполагает определение различных значений K (т.е. количество кластеров). Максимальным вероятность данных по K = 5. Высокая степень кластеризации была определена у всех пород, за исключением немецкого курцхаара. 90% или более геномов, выявленных у остальных пород, возникли из одного кластера.

Сетевой анализ митохондрий в гаплотипах показал, что суки имеют происхождение от четырех групп генетически различных линий. Однако не ясно, откуда этот гаплотип появился и как распространялся в породах (График 2).

Выводы

Показатель гетерозиготности (61,7–68,3%) в каждой породе указывает на значительное количество прилития кровей иных, но родственных пород, поскольку эти, приливаемые породы, имеют одинаковое с ними происхождение (Arkwright 1902). Но этот показатель гетерозиготности выше, чем в других исследованиях, например, у самоедов - 31% (Kim et al. 2001) или 53% - у диких популяций волков (Roy et al. 1994; Garcı´a-Moreno et al. 1996). Не смотря на то, что эти породы происходят из ограниченного генофонда и неслучайного спаривания, а получены путем целенаправленной селекции и инбридинга, традиционных для практики выведения большинства пород собак (Fredholm & Wintero¨ 1995), у этих пород имеется низкий показатель Fis, что говорит о генетической изменчивости между близкими индивидуумами вследствие непородных спариваний (Gi = 0,5). Наиболее вероятным объяснением этих результатов является то, что эти породы возникли из широкого генетического разнообразия иных пород, поскольку они имеют высокую степень генетического разнообразия внутри своих популяций, о чем также свидетельствует высокая степень мутаций у микросателлитов (Irion et al. 2003). Самый высокий показатель прилития кровей иных пород у английского сеттера (Gi = 0,52), самый низкий у немецкого дратхаара (Gi = 0,48).

Также у этих пород относительно высока степень вариативности у аутосомно-микросателлитных маркеров (Fst = 11,2%). Примерно такие же показатели имеются у собак азиатского происхождения (Fst = 15,4%; Kim et al. 2001) или у собак испанского происхождения (Fst = 10%; Jordana et al. 1992). Тем не менее, эти показатели значительно меньше, чем полученные Parker et al. в 2004 году (Fst = 27%), когда был проведен анализ происхождения 85 пород собак.

Предком английского сеттера и английского пойнтера является старо-испанский пойнтер, который ввозился в Великобританию в течение 14-17 веков. Кроме того, тому есть письменные доказательства, что с начала 18 (после подписания Утрехтского договора) и до 19 века, короткошерстный старо-испанский пойнтер в Великобритании смешивался с другими легавыми и нелегавыми породами для выведения английского пойнтера, который, в свою очередь, с конца 19 и до начала 20 века, распространился по Европе (Arkwright 1902; Contera 1982; Sanz Timo´n 1982). Английский пойнтер и немецкий курцхаар, имеют признаки общих предков, которые они унаследовали либо от старо-испанского пойнтера непосредственно из Испании, либо немецкие курцхаары унаследовали их от собак-помесей староиспанских пойнтеров с Британских островов; см. Таблицу 2.

Несколько mtDNA гаплотипов бретонского эпаньёля отличаются от гаплотипов английского пойнтера и английского сеттера, что отражает несколько иное происхождение данной породы. Постепенное распространение длинношерстных старо-испанских пойнтеров с их родины в Пиренеях и до французской провинции Бретань, проводилось, главным образом, с помощью постоянного вывоза кобелей, которых затем скрещивали с местными суками. Они и стали предками различных видов спаниелей (бретонского эпаньёля, а также остальных 22 пород спаниелей). В конце 19 века этих собак использовали для выведения английского сеттера, английского пойнтера и различных видов британских спаниелей (De Benito 1998*) (* ! Это не научный факт! Эти сведения взяты из испанской книги «El epagneul bretón» Eduardo de Benito Ruiz, который является автором множества публикаций о собаках). 


Староиспанский гладкошерстный пойнтер, George Stubbs


Испанский пойнтер, Reinagle

Отсутствие генетических различий между породами немецкими курцхаар и дратхаар, выявленное в результате анализа Y-хромосом (передача по отцовской линии) и митохондриального ДНК (передача по материнской линии), подтвердило гипотезу их общего происхождения. Историческая информация свидетельствует, что испанские короткошерстные легавые, ввозились в Центральную Европу в 1467 году (Eggert 1984), где скрещивались с местными собаками, из которых позднее образовались породы прапредков различных пород немецких легавых. В Испании, порода бургосского пойнтера появились в 18 веке от скрещивания испанских гончих и староиспанских пойнтеров. Эта новая порода в массовом порядке вывозилась в Германию в течение 19 и начале 20 веков, где они скрещивались со старонемецким пойнтером и менее значительно с английским пойнтером, чтобы создать современного немецкого курцхаара (Sanz Timo´n 1982). Гетерозиготный анализ показал, что немецкие дратхаары имеют в себе значительные крови различных Wahlund. Этоа порода была создана в конце 19 - начале 20 века, путем скрещивания немецкого курцхаара, гриффона Кортальса, немецкого Stichelhaar и пудельпойнтера (эта последняя порода была получена путем скрещивания английского пойнтера и пуделя) (Giulliani 2004).


Голова современного бургосского пойнтера

Acknowledgement

The authors thank the Spanish Hunting Federation for providing the blood samples and partially funding this research.

 

---